Input的峰为什么高于IP¶
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为什么会这样？¶
对于Chip-seq/m6A等需要input的实验设计中，因为Input根本就没加抗体，所以Input是不会有结合的，此时即使IP效果再不好，应该也不会发生Input信号高于IP的情况，即使IP没有富集效果也就相当于另一个Input，信号应该跟Input本身差不多(亦或者Input在TSS/TES等附近应该不会有一个很尖很高的峰出现)，即如下的情况：
发生该情况的原因为有如下几种原因：
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取材-建库实验-测序-分析过程中，某一个环节样本分组可能标记反了；
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实验操作不当，例如：抗体孵育时间不够，酶的问题(批次问题(IP和Input用的是两个批次的酶?)；孵育时间，ps：cut&tag实验中，TN5酶的孵育时间不要太长，否则后期比对率这些会被影响)，当然专业的操作员是不会犯这样的低级错误的；
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样本/细胞被特殊处理过，例如Chip-seq实验的样本/细胞如果被冻存过，复苏后它的DNA会被一定的损伤，DNA小片段化会更严重，抗体结合的效果就会不如预期，可能会出现大范围的结合现象(理论上是非特异性结合)；下图是一个真实案例，客户的细胞被冻存过，导致基因的结合位点没有特异性(文献研究显示应该是在这些基因的3'UTR区域有很强的结合信号)；
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技术分析层面，
deeptools先转换为bigwig时，scale参数是否正确设置，有没有设置为倒数(尤其是当IP和Input的数据量差异很大时)； -
PCR的问题，理论上Input样本的reads要应该是随机扩增的，对于转录本的覆盖应该是比较均匀覆盖的，但实际上并非如此，PCR往往会对某些转录本有偏好扩增，这也可能会导致Input在特定区域出现很多非随机的峰。如果这个峰刚好出现在TSS区域，也会造成Input的TSS高峰。
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研究目的蛋白的结合特性，这个是最关键的，也是最容易被忽略的，很多时候目的蛋白可能是在全基因范围内都是有结合分布的，或者蛋白的偏好性结合位点不在TSS/TES，然而我们上图往往只看TSS和TES上下游区域的数据分布情况，这时仅看TSS分布图显然是不合理的。
Note：TSS上下游通常是组蛋白和转录因子主要结合、调控的区域，所以也是大量出现结合峰的区域，如果研究的是组蛋白和转录因子时，TSS分布图确实比较关键了。
遇到这样的问题该怎么处理？¶
既然知道了大致的原因，那么相关的处理方案可以如下：
- 确认：取材-建库实验-测序-分析过程等过程样本的分组信息是否无误；
- 确认样本是否有被特殊处理，例如冻存等；
- 确认IP实验是否发生问题，可以查看WB质检结果，WB质检结果看来一切正常: WB显示IP较Input有富集，且富集效果较好，IP上清未检测到目的蛋白；
- 确认数据分析的处理是否得当，例如scale参数设置，否则会影响可视化的趋势；数据量差异较大时，可以进行down-sample试试；
- 分析IP和Input的insert长度分布是否存在很大差别，duplicate ratio是否差异很大，但想想就可以知道，两个样本应该会存在很大的差距的，毕竟一个做了IP富集，一个没做IP富集，比较都不一样大了，但依然可以分析出来作为参考；
- 确定蛋白的特性(推荐：文献和试剂厂商)，尤其是其结合区域的偏好性，到底是不是TSS/TES，如果不是，可以换成类似于genebody的图来先看看特异性结合位点。
数据还能不能用？¶
数据的TSS分布只是数据分析质控中的一项，用于数据层面初步评估IP实验的效果，除此之外我们还需要评估重复性/文库复杂度/FRIP/peak分布等等，并不是TSS分布不符合预期就直接说IP有问题或者数据不能用；当TSS的分布不符合预期但又要死磕想要一个符合预期的TSS分布图时，我们可以采取如下做法：
- 利用bedtools提取peak所在基因的TSS上下游5kb的reads数据(直接提取Peak上下游3kb的reads数据也可以)；
- 对提取的数据再次利用
deeptools进行bigwig的生成； - 数据TSS分布的可视化。
IP效果不好，IP的峰比Input的高的不是很明显时，也可以使用如上的方法试一试效果。
至于数据还能不能用，原则是只要：数据重复性/文库复杂度/FRIP/peak分布等问题不大，有显著差异的peak存在，那么数据还可以用于后续分析的，毕竟数据也是花了钱的，可以做一些探索性分析。此外也不乏用不好的数据发现很多新东西的研究。
